シリーズ：ちょっと測ってみました
だしの元はなに？
料理の味の決め手となる「だし」。あなたが食べる料理の「だし」の元が何であるか興味が湧くことはありませんか？
モバイルPCR装置を使って、実際に中華だしスープを調べてみました。
試料
牛中華だし（Y社製）0.1gと純水0.9mLの懸濁液
前処理
ボルテックスにて30秒撹拌、5分間放置（遠心なし）
これを①10倍希釈、②100倍希釈、③1000倍希釈し
中心付近から１μL採取し試料とする
反応組成
| μL | 備 考 (終濃度) | |
| 酵素；KAPA 3G Plant(2.5U/μL) | 0.8 | 2U/reaction |
| Buffer （×2） | 8 | x1 |
| F-Primer:ウシ/ブタ/ニワトリ (各100μM)※1 | 0.06/0.06/0.1 | 400/400/600nM |
| R-Primer:ウシ/ブタ/ニワトリ (各100μM)※1 | 0.13/0.14/0.1 | 800/900/600nM |
| Probe:ウシ/ブタ/ニワトリ (各100μM)※1 | 各0.03 | 各200nM |
| MgCl2(25mM) | 0.8 | 1.25mM |
| 試料 | 1 | |
| PCR grade water | 4.7 |
反応試料Total 16μL
プログラム
| 工程 | 温度 | 時間 | ||
| 初回変性 | 95℃ | 15sec | ||
| アニーリング・伸長 | 60℃ | 30sec | 50cycle | |
| 変性 | 95℃ | 4sec | ||
結果
ウシの信号のみ増加したので材料は牛であることが分かり、10,000倍希釈しても測定できた。
この時のリアルタイムPCRの増幅曲線を下図に示す。
測定はウシ・ブタ・ニワトリのマルチプレックスで実施
※1 プライマー・プローブ配列
| Tm | |
| Cow-Primer F 5′-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3′ (20mer) | 66.8 |
| Cow-Primer R 5’-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3′ (24mer) | 65.4 |
| Cow-probe 5’FAM-CATCATAGCAATTGCCATAGTCCAC-BHQ1-3’ (25mer) | 72.9 |
| Pig-Primer F 5′-CTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3′ (22mer) | 66.2 |
| Pig-Primer R 5′-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3′ (25mer) | 65.0 |
| Pig-probe 5’ROX-AACAGCTTTCTCATCAGTTACACACAT-BHQ2-3′ (27mer) | 70.2 |
| Chicken-Primer F 5′-TCTGGGCTTAACTCTCATACTCACC-3′ (25mer) | 65.6 |
| Chicken-Primer R 5′-GGTTACTAGTGGGTTTGCTGGG-3′ (22mer) | 65.6 |
| Chicken-probe 5’Cy5-CATTCCTAACACTAGCCCTATTCTCC-3’BHQ3 (26mer) | 70.3 |
(株)日本遺伝子研究所製
Tm値計算は最近接塩基法による。ただしプローブは日本遺伝子研究所様の計算法による。
参考論文：Tanabe et al., A Real-Time Quantitative PCR Detection Method for Pork, Chicken, Beef, Mutton, Horseflesh in Foods.
Biosci. Biotechnol. Biochem., 2007, 71(12), 3131-3135
