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牛白血病プロウイルスDNA測定

シリーズ:まじめに測ってみました

牛白血病プロウイルスDNA測定

あまり知られてはおりませんが、牛白血病のうち牛白血病ウイルス(bovine leukemia virus)により引き起こされる地方病性牛白血病が近年増加傾向にあるとのことです。
そこで、ウイルスにより組み込まれたDNA(プロウイルスDNA)を測定できるか、モバイルPCR装置で調べてみました。

試料

と肉(牛)全血

前処理

凍結保管(-80℃)血液を遠心、PBS洗浄2回し試料とする

反応組成
μL 備 考 (終濃度)
酵素;KAPA 3G Plant(2.5U/μL) 0.6 1.6U/reaction
Buffer (x2) 8 x1
F-Primer (100μM) ※1 0.1 1000nM
R-Primer (100μM) ※1 0.1 1000nM
Probe (100μM) ※1 0.05 600nM
試料 1
PCR grade water 6.2

反応試料Total 16μL

プログラム
工程 温度 時間
初回変性 95℃ 15sec
アニーリング・伸長 60℃ 10sec 45cycle
変性 95℃ 3.5sec
結果

凍結保管の全血からダイレクトPCRにて牛白血病プロウイルスDNAが測定できる事が分かった。

※1 下記文献より改変

プライマー・プローブ配列
Tm
Primer F 5′-CCTCAATTCCCTTTAAACTA-3′ (20mer) 60.7
Primer R 5’-GTACCGGGAAKACTGGATTA-3′ (20mer) 60.7
probe 5’FAM-AACGCCTCCAGGCCCTTCA-BHQ1-3’ (19mer) 68.8

(株)日本遺伝子研究所製
Tm値計算は日本遺伝子研究所様の計算法による。
塩基多様性が見られたため、塩基多様性部位に混合塩基K=(T or G)を導入した。

参考文献:Journal of Virological Methods 189 (2013) 258– 264
測定にご協力いただいた、宮崎県都城食肉衛生検査所様に深く感謝いたします。