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Gの存在

シリーズ:まじめに測ってみました

Gの存在

わが家に、でましたっ!、でてしまいました。。。
Gはいったいどこからやってきて、どこに隠れているのでしょう?
チャバネゴキブリをモバイルPCR装置で調べてみました。

試料

チャバネゴキブリ 肢
チャバネゴキブリ フン

前処理

検量線測定:GenCheck DNA Extration Reagent (FASMAC社)にて肢から遺伝子を抽出
フンの測定:PBS(-)撹拌希釈

反応組成
μL 備 考 (終濃度)
酵素;KAPA 3G Plant(2.5U/μL) 0.6 1.5U/reaction
Buffer (×2) 8.5 x1
F-Primer:チャバネG (100μM) 0.1 600nM
R-Primer:チャバネG (100μM) 0.1 600nM
Probe:チャバネG (100μM) 0.05 300nM
MgCl2(25mM) 0.85 1.25mM
試料 1
PCR grade water 5.8

反応試料Total 17μL

プログラム
工程 温度 時間
初回変性 95℃ 15sec
アニーリング・伸長 60℃ 10sec 50cycle
変性 95℃ 3.5sec
結果

【第一ステップ:検量線の作成】
試料
チャバネゴキブリ 肢
前処理
GenCheck DNA Extration Reagent (FASMAC社)にて肢から遺伝子を抽出
分光光度計にてDNA量を算出
(OD260値よりDNA濃度;249μg/mL)
段階希釈し上清1μLをテンプレートとし、検量線を作成

抽出DNAの希釈 希釈率
Log値
Ct値
原液
(DNA濃度;249μg/mL)
0 21.87
水で10倍希釈 -1 25.8
水で100倍希釈 -2 29.76
水で1,000倍希釈 -3 33.3
水で10,000倍希釈 -4 37.17
水で100,000倍希釈 -5 42.45
水で1,000,000倍希釈 -6 非検出

【第二ステップ:フンの測定】
試料
チャバネゴキブリ フン
前処理
フンを採取し、PBS(-) 100μLに、1~5個のフンを浸漬
ボルテックス5分、遠心12,000rpm10分にて抽出した上清1μLをテンプレートとし、ダイレクトPCR測定

第39回日本食品微生物学会にて日本板硝子株式会社より発表いたしました。
本試験に使用した検体を株式会社シー・アイ・シー様よりご提供をいただきました。