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カンピロバクター菌の測定

シリーズ:まじめに測ってみました

カンピロバクター菌の測定

厚生労働省の報告「2017年の食中毒発生状況」によると、病因物質別事件数発生状況では3割がカンピロバクターによるものであり、数は300件を超えて第1位とのことである。
カンピロバクターをモバイルPCR装置で調べてみました。

試料

C. jejuni 培養検体

前処理

検量線測定:

  1. 1E+6~1E+07 CFU/mLをプチット-カンピロ 10mL※1に植菌
  2. 42℃で 24時間培養(微好気培養)
  3. 培養懸濁液を段階希釈

培養懸濁液ダイレクトPCRの測定:

  1. 3種類の種菌濃度をプチット-カンピロ 10mLに植菌
  2. 6~48時間培養 (微好気培養)
  3. 2時間培養ごとに検体採取
反応組成
μL 備 考 (終濃度)
酵素;KAPA 3G Plant(2.5U/μL) 0.6 1.5U/reaction
Buffer (×2) 8 x1
LightMix Modular CampyloBacter 0.5
MgCl2(25mM) 0.8 1.25mM
試料 1
PCR grade water 5.1

反応試料Total 16μL

プログラム
工程 温度 時間
初回変性 95℃ 15sec
アニーリング・伸長 60℃ 15sec 50cycle
変性 95℃ 4sec
結果

【第一ステップ:検量線の作成】
試料
培養懸濁液(ダイレクトPCR)
前処理

  1. C. jejuni 1E+06~1E+07 CFU/mLをプチット-カンピロ 10mLに植菌
  2. 42℃で 24時間培養(微好気培養)
  3. 培養懸濁液を段階希釈し上清1μLをテンプレートとし、検量線を作成

同じサンプルを寒天培地で培養しコロニー数を算出

DNAの希釈 希釈率
Log値
Ct値
原液 (24hr培養) 0 21.01
水で10倍希釈 -1 24.96
水で100倍希釈 -2 28.64
水で1,000倍希釈 -3 33.22
水で10,000倍希釈 -4 36.28
水で100,000倍希釈 -5 42.30
水で1,000,000倍希釈 -6 非検出

【第二ステップ:培養2時間毎ダイレクトPCRの測定】
試料
培養懸濁液(ダイレクトPCR)
前処理

  1. 3種類の種菌濃度をプチット-カンピロ 10mLに植菌
  2. 6~48時間培養 (微好気培養)
  3. 2時間培養ごとに検体採取

※1 プチット-カンピロは株式会社 日研生物医学研究所様の商品名となります。
第39回日本食品微生物学会にて日本板硝子株式会社より発表いたしました。
本試験はNPO法人バイオメディカルサイエンス研究会様にて実施、ご提供をいただきました。