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ノロウイルスの測定

シリーズ:まじめに測ってみました

ノロウイルスの測定

この冬のさなか、突然の腹痛。。。
昨日の献立を思い浮かべ「あぁ、自分やってもうたな」とつぶやきながら、次亜塩素酸を薄めスプレー瓶に詰め、トイレに籠城。

厚生労働省の報告「2017年の食中毒発生状況」によると、病因物質別事件数発生状況では2割がノロウイルスによるものであり、数は200件を超えて第2位。カンピロバクターとならび毎年第1位2位を争う原因因子とのことである。
ノロウイルスをモバイルPCR装置で調べてみました。

試料

Norovirus GII型の合成RNA(ATCC: VR-3235SD)

RT酵素

THUNDERBIRD Probe One-step qRT-PCR Kit (TOYOBO)

反応組成
  μL 備 考 (終濃度)
RT Enzyme Mix 0.5 0.5μL/reaction
DNA Polymerase 1 1.0μL/reaction
2x Reaction Buffer 8.5 1x
COG2F forward primer 0.136 800nM
ALPF forward primer 0.136 800nM
COG2R reverse primer 0.136 800nM
RING2AL-TP probe 0.34 200nM
RING1-TP(b) probe (FAM添加) 0.255 150nM
試料 1  
PCR grade water 5  

反応試料Total 17μL

プログラム
工程 温度 時間  
逆転写 42℃ 200sec  
初回変性 95℃ 15sec  
アニーリング・伸長 55℃ 10sec 50cycle
変性 95℃ 3.5sec
結果

今回使用したTHUNDERBIRD Probe One-step qRT-PCR Kit (TOYOBO)においてはRNA量(/reaction)が、4.4 x 10^5~4.4 x 10^1 copies の範囲で検出可能であり、Ct値との相関性が保たれていることが明らかになった。

今回の条件では、4.4×10^0copies/reaction について電気泳動を行うと、想定されるPCR産物はほとんど無く、Ct値の相関性も悪いことから、有効な結果ではないと判断した。

各社のRT用kitの中では、条件が一致していないので優劣はつけがたいが
本KITの掲載の条件において、感度の観点から優秀な結果と言える。