このページを印刷する このページを印刷する

腸管出血性大腸菌(O157、O26)の測定

シリーズ:まじめに測ってみました

腸管出血性大腸菌(O157、O26)の測定

(株)ゼンショーホールディングス様、日本ジェネティクス(株)様のご協力で実施

大腸菌O157:H7に代表される腸管出血性大腸菌(EHEC)はベロ毒素(Verotoxin=VT)を産生する大腸菌。
乾燥、低温、冷凍に強く、O157:H7は酸にも強い。感染力は強く、少量の菌だけでも発症してしまう厄介者。
そこでモバイルPCR装置でベロ毒素産出遺伝子を測定が可能か調べてみました。

試料

サンプルA:牛肉表面から採取したO157をmEC培地に濃度約10cfu/L調整
サンプルB:同様に採取したO26をEC培地に濃度約10cfu/L調整、さらに夾雑菌を付加(約3000cfu/L)

前培養

42℃で①4時間、②8時間、④11時間培養、更に③8時間培養液を10倍希釈
※③は7時間培養に相当

前処理

培養後98℃-8分の熱処理

反応組成

酵素;KAPA 3G Plant (Kapa Biosystems)
プライマー及びプローブ;食安監発1120第3号相当
その他組成は日本ジェネティクス(株)様による

プログラム

検出時間は約25分(日本ジェネティクス(株)様による)

結果

8時間の前培養後、熱処理だけの前処理で10cfu/Lの腸管出血性大腸菌の測定ができた。7時間の前培養でも可能と考えられ、測定含めて8時間内(就業時間内)での判定が可能になると考えられる。

測定はVT1,VT2のマルチミックスで実施

VT1-Primer F    5’-GGA TAA TTT GTT TGC AGT TGA TGTC-3’ (25mer)
VT1-Primer R    5’-CAA ATC CTG TCA CAT ATA AAT TAT TTC GT-3’ (29mer)
VT1-probe       5’FAM-CCG TAG ATT ATT AAA CCG CCC TTC CTC TGG A-3’BHQ1 (31mer)
VT2-Primer F    5’- GGGCAGTTATTTTGCTGTGGA -3’ (21mer)
VT2-Primer R    5’-GAAAGTATTTGTTGCCGTATTAACGA-3’ (26mer)
VT2-probe         5’FAM-ATGTCTATCAGGCGCGTTTTGACCATCTT-BHQ2’ (29mer)