増幅条件の目安

増幅条件で主に検討が必要な項目は、以下の通りです。
  • ①アニール・伸張温度(中温と呼んでいます)
  • ②アニール・伸張時間
  • ③変性温度(=ホットスタート温度:高温と呼んでいます)
  • ④ホットスタート時間
  • ⑤変性時間
これらも具体的数字は検査対象によりますが、以下の値で通常、大丈夫です。
  • ③は通常95℃
  • ④は15秒程度
  • ⑤は4~5秒で十分な事が多いです。

従ってポイントは①と②です。

中温の温度はプライマーとプローブのTm値に依存しますが、プライマーのTm値の数℃下が良さそうです。中温の温度は至適値があるため、上げすぎても急激に反応が悪くなり、下げすぎても反応は徐々に悪くなります。そのため、最初、低めの設定値から徐々に上げていくことをお勧めします。

中温の時間は、最初、少し長めに設定し、徐々に短くしていくことで、至適時間を見つけることをお勧めします。

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